Etablering av MODY knock-out line in zebrafish (Danio rerio)
1. Formål
Sebrafisk har blitt stadig mer verdifull som translasjonsforskning modell, og er nå i bruk over hele verden i studier på humane sykdomsmekanismer, inkludert også som modell for å studere patologien av diabetes.
Vi har tidligere beskrevet mutasjoner i monogene diabetesgener (MODYs) som forårsaker autosomal dominant arvelig diabetes, med tidlig debut, samt genvarianter i samme MODY gener som risikofaktorer for type 2 diabetes (debut senere i livet). Noen former for MODY er assosiert med sykdom ikke bare i pankreas, men også i nyre og andre organ.
Vi skal etablere en knock-out (KO) linje i sebrafisk, med mutasjoner i genet HNF1B assosiert med MODY5 sykdom. Målet med linjen og forsøket er å studere molekylære mekanismer bak organ-spesifikk patologi (for eksempel pankreas hyperplasi, nyrecyster) som resultat fra mutasjon i HNF1B genet som koder for HNF-1B transkripsjonsfaktoren.
2. Skadevirkninger
Ved mutering av enkeltgen kan man ikke utelukke lidelse hos fisken. Vi har lang erfaring med å registrere velferd hos genredigert fisk vha velferdsindikatorer som adferd, vekst og appetitt. Vår intensjon er å gjøre samme oppfølging av fisken i dette prosjektet, og forventer kun lett belastning på fisk i løpet av dette prosjektet.
For å identifisere fisk som bærer ønsket mutasjon, vil vi klippe av en del av halefinnen (ca 1/3-part av ytterste del) for å isolere DNA fra enkeltindivider. Dette blir gjort under bedøvelse, og fisken legges tilbake i rent vant for oppliving innen ett (1) minutt. Kun ytterste del av finnen blir klippet, for å unngå blodårer og nerveceller. Inngrepet regnes som kun lett belastende.
Analyser ved konfokal mikroskopi blir gjort i løpet av embryo og juvenil stadiet, og utgjør ingen eksperimentelle inngrep hos fisken. Fiskene vil være bedøvet (MS-222) under mikroskopering, og gjenopplives i friskt vann etter mikroskopi.
Vevsprøver for andre analyser vil bli foretatt etter avliving, på adult stadiet.
3. Forventet nytteverdi
Vi forventer å få ny forståelse for årsakssammenhenger mellom endringer i transkripsjonsfaktor reguleringen som involverer HNF-1B i forskjellige vevsspesifikke organ og sykdomsutvikling i slike, som på sikt kan komme MODY pasienter til gode i form av vevsspesifikk behandling.
4. Antall dyr og art
Vi skal bruke sebrafisk (Danio rerio). For en fullverdi analyse (se vedlegg), må vi ha 932 fisk for hver sebrafisk linje mutasjonen skal etableres i. Det vil si 1864 fisk totalt siden fenotype skal analyseres i 2 ulike sebrafisk linjer med ulik genotypebakgrunn (2 x 932 = 1864).
5. Hvordan etterleve 3R
Målene for forsøket er å studere underliggende molekylære mekanismer, forårsaket av HNF1B mutasjoner, bak fenotyper i nyre, pankreas og reproduksjonsorganer hos MODY5 pasienter. Det er derfor nødvendig med in-vivo forsøk. Vi vet fra tidligere forsøk og individuell variasjon hos fisk at vi må ha et tilstrekkelig antall individer fra hvert uttak for å få et statistisk grunnlag til å tolke resultatene. Vi vil tilstrebe å holde antall fisk på et minimum.
Sebrafisk har blitt stadig mer verdifull som translasjonsforskning modell, og er nå i bruk over hele verden i studier på humane sykdomsmekanismer, inkludert også som modell for å studere patologien av diabetes.
Vi har tidligere beskrevet mutasjoner i monogene diabetesgener (MODYs) som forårsaker autosomal dominant arvelig diabetes, med tidlig debut, samt genvarianter i samme MODY gener som risikofaktorer for type 2 diabetes (debut senere i livet). Noen former for MODY er assosiert med sykdom ikke bare i pankreas, men også i nyre og andre organ.
Vi skal etablere en knock-out (KO) linje i sebrafisk, med mutasjoner i genet HNF1B assosiert med MODY5 sykdom. Målet med linjen og forsøket er å studere molekylære mekanismer bak organ-spesifikk patologi (for eksempel pankreas hyperplasi, nyrecyster) som resultat fra mutasjon i HNF1B genet som koder for HNF-1B transkripsjonsfaktoren.
2. Skadevirkninger
Ved mutering av enkeltgen kan man ikke utelukke lidelse hos fisken. Vi har lang erfaring med å registrere velferd hos genredigert fisk vha velferdsindikatorer som adferd, vekst og appetitt. Vår intensjon er å gjøre samme oppfølging av fisken i dette prosjektet, og forventer kun lett belastning på fisk i løpet av dette prosjektet.
For å identifisere fisk som bærer ønsket mutasjon, vil vi klippe av en del av halefinnen (ca 1/3-part av ytterste del) for å isolere DNA fra enkeltindivider. Dette blir gjort under bedøvelse, og fisken legges tilbake i rent vant for oppliving innen ett (1) minutt. Kun ytterste del av finnen blir klippet, for å unngå blodårer og nerveceller. Inngrepet regnes som kun lett belastende.
Analyser ved konfokal mikroskopi blir gjort i løpet av embryo og juvenil stadiet, og utgjør ingen eksperimentelle inngrep hos fisken. Fiskene vil være bedøvet (MS-222) under mikroskopering, og gjenopplives i friskt vann etter mikroskopi.
Vevsprøver for andre analyser vil bli foretatt etter avliving, på adult stadiet.
3. Forventet nytteverdi
Vi forventer å få ny forståelse for årsakssammenhenger mellom endringer i transkripsjonsfaktor reguleringen som involverer HNF-1B i forskjellige vevsspesifikke organ og sykdomsutvikling i slike, som på sikt kan komme MODY pasienter til gode i form av vevsspesifikk behandling.
4. Antall dyr og art
Vi skal bruke sebrafisk (Danio rerio). For en fullverdi analyse (se vedlegg), må vi ha 932 fisk for hver sebrafisk linje mutasjonen skal etableres i. Det vil si 1864 fisk totalt siden fenotype skal analyseres i 2 ulike sebrafisk linjer med ulik genotypebakgrunn (2 x 932 = 1864).
5. Hvordan etterleve 3R
Målene for forsøket er å studere underliggende molekylære mekanismer, forårsaket av HNF1B mutasjoner, bak fenotyper i nyre, pankreas og reproduksjonsorganer hos MODY5 pasienter. Det er derfor nødvendig med in-vivo forsøk. Vi vet fra tidligere forsøk og individuell variasjon hos fisk at vi må ha et tilstrekkelig antall individer fra hvert uttak for å få et statistisk grunnlag til å tolke resultatene. Vi vil tilstrebe å holde antall fisk på et minimum.